Mixed hematopoietic chimerism and immune tolerance through bone marrow transplantation and infusion of regulatory T cells in a preclinical large animal model

Induction of transplantation tolerance to kidney allografts has been achieved through transient mixed hematopoietic chimerism in a non-myeloablative approach in both, non-human primates and humans. In order to make this approach applicable to other organs less tolerogenic such as lung or heart, we studied an approach to induce long-term mixed chimerism (instead of transient) through bone marrow transplantation (BMT) and infusion of recipient in vitro-expanded regulatory T cells (Tregs) in a non-human primate model (Cynomolgus macaque). Immunosuppression monotherapy was discontinued shortly after BMT. Donor-recipient pairs were major-histocompatibility-complex (MHC) mismatched in order to increase the applicability of this approach. First, we studied the biology of Mauritian Cynomolgus macaque (MCM) Tregs and developed five in vitro Treg expansion protocols for translational studies that included the use of artificial antigen presenting cells (aAPCs), donor peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or a pool from different donors of CD40L-stimulated B cells (CD40L-sBc). Tregs from all protocols suppressed the proliferation of anti-CD2CD3CD28 bead-stimulated autologous PBMCs albeit with different potencies, varying from 1:2-1:4 Treg:PBMC ratios, up to >1:32. Treg expansion varied between protocols but at least 1,000 fold expansion was achieved with all of the them, up to >7,000 folds. Reculture of cryopreserved Tregs permitted reexpansion with improved suppressive activity. Occasionally, CD8 contamination was observed and resolved by resorting. Specificity studies showed suppression of PBMCs from autologous cells, cells from the same donor used for stimulation during the Treg cultures and from a third‐party PBMC responders, suggestive of the polyclonallity of these Tregs. Similar to humans, the Treg–specific demethylated region (TSDR) within the FoxP3 locus correlated with suppressive activity and expression of FoxP3. Contrary to humans, FoxP3 expression did not correlate with CD45RA or CD127 expression.We then investigated the efficacy of ex vivo expanded Tregs to promote the induction of durable mixed chimerism along with BMT. A total of ten recipients received Tregs with different doses of bone marrow (BM) and outcomes were compared to five controls that did not receive Tregs. Prolonged chimerism was observed in Treg-treated recipients that received a high BM dose with infusion of Tregs compared to those that received low-dose BMT or did not received Tregs. Graft-versus-host disease (GVHD) was observed in four recipients, two controls and two animals that received Tregs expanded with CD40L-sBc. In those animals in which prolonged chimerism was observed, a higher number of peripheral Tregs was detected in blood compared to baseline levels and in vitro, the anti-donor response was decreased, suggestive of donor tolerance. BM rejection and chimerism loss was associated with an inversion of the CD4 and CD8 ratios and an increase in the CD8 absolute counts. Cytomegalovirus (CMV) was detected in all recipients post-BMT independently of the administration of Tregs. CMV reactivation was associated with an increase in the CD8 counts and with the loss of the BM graft. Therefore, promptly antiviral treatment was stablished for an early CMV control. In conclusion, Tregs were able to expand the duration of chimerism (albeit transient) when administered with high-dose BMT across MHC barriers without immunosuppression. <br /

Essays on environment and international trade using MRIO models

Esta tesis está escrita en un contexto de un periodo de tiempo marcado por grandes desajustes económicos con periodos de aceleración y desaceleración de la economía global. En este contexto de creciente incertidumbre, así como en sus efectos sobre la renta, el empleo y los factores medioambientales, marcados por el crecimiento del comercio internacional y las interdependencias de los países, es donde se sitúa el objetivo principal de esta tesis doctoral. El reciente proceso de globalización, el cambio tecnológico y el aumento del comercio internacional han provocado que los procesos productivos sean cada vez más globales, lo que implica estructuras interdependientes que vinculan bienes, procesos y países. Los bloques económicos tradicionales y los vínculos sectoriales dentro de los países coexisten con el aumento de las dependencias mundiales. Por otra parte, el comercio ha sido considerado tradicionalmente como un elemento clave en el impulso del progreso económico de un país, así como la competitividad y la especialización. Dicho impacto del comercio internacional sobre el crecimiento económico ha sido ampliamente estudiado en la literatura, tanto desde el punto de vista teórico como empírico.De acuerdo a este contexto, la tesis profundiza en el papel que juega el comercio internacional, el cambio tecnológico y estructural, y la composición de la demanda interna de los diferentes países en su evolución e incorporación a las cadenas globales de valor desde una perspectiva económica, histórica y medioambiental. La perspectiva económica permite entender estos procesos como inputs necesarios para lograr el desarrollo y avance de los países. La perspectiva histórica nos ayudará a conocer el pasado más reciente para comprender el presente y construir posibles escenarios de evolución futura. Finalmente, la perspectiva medioambiental es necesaria dada la transcendencia actual de asuntos como el cambio climático y sus consecuencias, su conexión con la actividad económica y los procesos de globalización, así como la necesaria y urgente necesidad de cooperación internacional para combatir estos problemas.Además, los trabajos sobre la importancia de la desigualdad y convergencia de rentas entre países, y el papel desempeñado por fenómenos recientes como la globalización o el progreso tecnológico en el crecimiento, han experimentado un fuerte auge en los últimos años. La mayoría de ellos reconocen a la globalización y al cambio tecnológico como dos de los principales impulsores del reciente crecimiento económico de los países. La reducción de las barreras de entrada a los mercados y el aumento de la internacionalización han permitido a los países emergentes reducir las brechas de ingresos, lo que debería llevar a la convergencia económica.Por tanto, la investigación aborda cuestiones relacionadas con la economía internacional, la economía regional y la economía ambiental, y se basa en herramientas comúnmente usadas en el análisis económico como la metodología input-output, para estudiar la evolución de los flujos comerciales intercambiados entre países y sectores, así como en técnicas tradicionales para medir la desigualdad a nivel económico, social y ambiental. Estas herramientas e indicadores serán extendidas para el estudio de nuevas cuestiones relacionadas con la desigualdad intrarregional e intersectorial, la desigualdad a lo largo de las cadenas globales de valor y sus impactos sobre el medio ambiente.<br /

La reacción de hipersensibilidad tipo I en la especie canina: dermatitis atópica canina y otras enfermedades alérgicas

La reacción de hipersensibilidad tipo I (hipersensibilidad inmediata) es una reacción inmediata que se produce cuando un antígeno se combina con un anticuerpo (IgE) preformado (creado por una exposición sensibilizante al mismo antígeno) y se une a los mastocitos provocando una reacción instantánea: sustancias inflamatorias y vasoactivas son liberadas por esas células, causando vasodilatación, edema, quimiotaxis eosinofílica, prurito y broncoconstricción. Los ejemplos más importantes de reacciones de hipersensibilidad inmediatas en medicina veterinaria van desde trastornos alérgicos sistémicos (anafilaxis) hasta trastornos alérgicos específicos tales como alergias respiratorias y oculares (rinitis alérgica, bronquitis y conjuntivitis), alergias alimentarias y alergias cutáneas. Los trastornos alérgicos de la piel son los más relevantes en la especie canina, especialmente un síndrome multifactorial denominado Dermatitis Atópica Canina, sufrido por entre el 10 y el 15% de la población canina. En la primera década del siglo XX, el científico austriaco Clemens von Pirquet introdujo el término "alergia" en el mundo de la medicina humana. Posteriormente el concepto se extendió al campo veterinario y ya en 1941 se informó de un caso de manifestaciones clínicas compatibles con atopia canina en un perro afectado de rinitis alérgica estacional. Justo en 1971 se describieron inicialmente los signos clínicos de CAD. Las condiciones alérgicas suelen ser multifactoriales y en ellas intervienen tanto factores intrínsecos, únicos del animal, como factores extrínsecos, relacionados con el medio ambiente y con el microambiente cutáneo. Una comprensión completa de estos factores es necesaria si la condición se quiere abordar con éxito desde el punto de vista diagnóstico y terapéutico

Update on commonly used molecular typing methods for Clostridioides Difficile

This review aims to provide a comprehensive overview of the significant Clostridioides difficile molecular typing techniques currently employed in research and medical communities. The main objectives of this review are to describe the key molecular typing methods utilized in C. difficile studies and to highlight the epidemiological characteristics of the most prevalent strains on a global scale. Geographically distinct regions exhibit distinct strain types of C. difficile, with notable concordance observed among various typing methodologies. The advantages that next-generation sequencing (NGS) offers has changed epidemiology research, enabling high-resolution genomic analyses of this pathogen. NGS platforms offer an unprecedented opportunity to explore the genetic intricacies and evolutionary trajectories of C. difficile strains. It is relevant to acknowledge that novel routes of transmission are continually being unveiled and warrant further investigation, particularly in the context of zoonotic implications and environmental contamination

Caracterización de células mesenquimales de ovino infectado con scrapie

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) son enfermedades neuro-degenerativas sin tratamiento posible. En las últimas décadas se han desarrollado modelos celulares tanto para el estudio de los mecanismos moleculares de la enfermedad como para su posible aplicación en el diagnóstico precoz y para la evaluación de tratamientos in vitro. Sin embargo, existen muy pocos modelos celulares capaces de multiplicar la proteína prión patológica, la mayoría son derivados murinos que requieren la adaptación previa del aislado priónico en ratón antes de su multiplicación. Uno de los objetivos principales del presente estudio consistió en desarrollar un modelo celular que permitiera estudiar el scrapie en células procedentes del hospedador natural de la enfermedad, la especie ovina. Para ello se han estudiado y caracterizado las células mesenquimales (MSC) ovinas obtenidas a partir de sangre periférica y médula ósea. Se ha seleccionado la sangre periférica como tejido de fácil acceso, y la médula ósea por considerarse el lugar de mayor concentración de MSC en animales adultos. En las EET la proteína prión patológica se acumula principalmente en el sistema nervioso central (SNC) y es allí donde ejerce su acción patológica, por ello se ha analizado la plasticidad de las MSC ovinas para su diferenciación neurogénica. Por otra parte, se ha estudiado la susceptibilidad de estas células frente a la infección con el agente de la enfermedad de scrapie. Además, las MSC se han propuesto como posible terapia para las EET por lo que el segundo gran objetivo de esta tesis consistió en analizar los efectos que la enfermedad pueda desencadenar sobre las características de las MSC y su posible infectividad. En este trabajo se describe por primera vez la posibilidad de aislar MSC a partir de sangre periférica de ovino. Tanto las MSC ovinas de este origen como las obtenidas a partir de médula ósea expresan proteínas y transcritos de marcadores de superficie característicos de células mesenquimales. Tal y como se ha descrito en otras especies, se ha observado gran variabilidad individual de las MSC ovinas, que parece afectar tanto a la capacidad de diferenciación como a la plasticidad de estas células. Las MSC ovinas expresan la proteína prión celular y son susceptibles a la infección con aislados priónicos procedentes de animales afectados por scrapie, si bien, a diferencia de lo que ocurre en las MSC de ratón, no parecen propagar la proteína prión patológica. Sin embargo, la infección de BM-MSC con proteína priónica reduce la capacidad de proliferación de las MSC. Este hecho podría deberse a un efecto tóxico del prión y a la inducción de procesos apoptóticos. Estas características ratifican el potencial de las MSC ovinas como modelo celular en el hospedador natural de la enfermedad de scrapie para estudios de toxicidad de la proteína prión

Gene expression profiling en association with prion-related lesions in the medulla oblongata of symptomatic natural scrapie animals.

The pathogenesis of natural scrapie and other prion diseases remains unclear. Examining transcriptome variations in infected versus control animals may highlight new genes potentially involved in some of the molecular mechanisms of prion-induced pathology. The aim of this work was to identify disease-associated alterations in the gene expression profiles of the caudal medulla oblongata (MO) in sheep presenting the symptomatic phase of natural scrapie. The gene expression patterns in the MO from 7 sheep that had been naturally infected with scrapie were compared with 6 controls using a Central Veterinary Institute (CVI) custom designed 4×44K microarray. The microarray consisted of a probe set on the previously sequenced ovine tissue library by CVI and was supplemented with all of the Ovis aries transcripts that are currently publicly available. Over 350 probe sets displayed greater than 2-fold changes in expression. We identified 148 genes from these probes, many of which encode proteins that are involved in the immune response, ion transport, cell adhesion, and transcription. Our results confirm previously published gene expression changes that were observed in murine models with induced scrapie. Moreover, we have identified new genes that exhibit differential expression in scrapie and could be involved in prion neuropathology. Finally, we have investigated the relationship between gene expression profiles and the appearance of the main scrapie-related lesions, including prion protein deposition, gliosis and spongiosis. In this context, the potential impacts of these gene expression changes in the MO on scrapie development are discussed

Endoplasmic reticulum stress and ubiquitin-proteasome system impairment in natural scrapie

Chronic accumulation of misfolded proteins such as PrPSc can alter the endoplasmic reticulum homeostasis triggering the unfolded protein response (UPR). In this pathogenic event, the molecular chaperones play an important role. Several reports in humans and animals have suggested that neurodegeneration is related to endoplasmic reticulum stress in diseases caused by the accumulation of misfolded proteins. In this study, we investigated the expression of three endoplasmic reticulum stress markers: PERK (protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase), BiP (binding immunoglobulin protein), and PDI (Protein Disulfide Isomerase). In addition, we evaluated the accumulation of ubiquitin as a marker for protein degradation mediated by the proteasome. These proteins were studied in brain tissues of sheep affected by scrapie in clinical and preclinical stages of the disease. Results were compared with those observed in healthy controls. Scrapie-infected sheep showed significant higher levels of PERK, BiP/Grp78 and PDI than healthy animals. As we observed before in models of spontaneous prion disease, PDI was the most altered ER stress marker between scrapie-infected and healthy sheep. Significantly increased intraneuronal and neuropil ubiquitinated deposits were observed in certain brain areas in scrapie-affected animals compared to controls. Our results suggest that the neuropathological and neuroinflammatory phenomena that develop in prion diseases cause endoplasmic reticulum stress in brain cells triggering the UPR. In addition, the significantly higher accumulation of ubiquitin aggregates in scrapie-affected animals suggests an impairment of the ubiquitin-proteasome system in natural scrapie. Therefore, these proteins may contribute as biomarkers and/or therapeutic targets for prion diseases

Autofagia y biomarcadores en las enfermedades priónicas

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs), o enfermedades priónicas, son un grupo de trastornos neurodegenerativos fatales que afectan a los animales y al hombre, caracterizados por la acumulación de una isoforma infecciosa (PrPSc) de la proteína prion celular (PrPc) en el sistema nervioso central (SNC). Utilizando el scrapie ovino como modelo animal de EET, en la presente Tesis Doctoral hemos analizado la posible implicación de la autofagia, un proceso intracelular fundamental que evita la acumulación de orgánulos dañados y proteínas mal plegadas, en la neuropatología asociada a estas enfermedades. Mediante estudios de expresión génica y determinación inmunohistoquímica de algunos de los marcadores de autofagia más utilizados en la actualidad, evaluamos la regulación de este proceso en ovino infectado de forma natural con scrapie clásico, en ovejas inoculadas experimentalmente con scrapie atípico y en el modelo murino transgénico Tg338, el cual sobreexpresa el alelo del gen ovino de la proteína prion (PRNP) más susceptible al scrapie clásico (VRQ).En estos modelos hemos identificado una disminución en los niveles de expresión de genes relacionados con la autofagia como ATG5 y un incremento del marcador p62, una proteína que se acumula en respuesta al deterioro degradativo autofágico, principalmente en las áreas del SNC más afectadas por la enfermedad. El análisis de las dos formas clínicas de scrapie, las cuales difieren en la distribución neuroanatómica tanto de las lesiones histopatólogicas como de los depósitos de PrPSc, nos ha permitido concluir, no sólo que la maquinaria autofágica se encuentra alterada durante el curso de la infección priónica, sino también que dicha alteración está relacionada con la neuropatología de la enfermedad y es en gran medida dependiente de las características lesionales particulares de la región del SNC analizada. Por otro lado, en la línea transgénica murina Tg338 hemos demostrado que la disfunción de la autofagia tiene lugar durante las fases tardías de la infección priónica. Aunque este modelo experimental muestra una regulación autofágica diferencial con respecto a ratones de tipo wild-type, probablemente debido a la sobreexpresión de la PrPc, en general, la línea murina Tg338 presenta una respuesta a la infección con scrapie clásico y una actividad autofágica similares a las observadas en el ovino, por lo que puede considerarse un método in vivo adecuado para estudiar la autofagia y las EETs de manera conjunta.En la actualidad, el único diagnóstico efectivo de las enfermedades priónicas se basa en la detección directa de la PrPSc en el SNC de manera post-mortem o en tejidos y fluidos periféricos mediante técnicas de amplificación in vitro. La detección de la PrPSc no se considera fiable para el diagnóstico in vivo, y algunas de las técnicas de amplificación son costosas y requieren de laboratorios especializados. En esta Tesis Doctoral hemos realizado diversos estudios dirigidos a la identificación de biomarcadores distintos a la PrPSc y a la validación de potenciales biomarcadores génicos ya identificados para proporcionar alternativas útiles a la metodología diagnóstica actual.Mediante RT-qPCR estudiamos la expresión de diez genes, cuya implicación en la propagación priónica había sido descrita previamente in vitro, en la médula oblongada de ovino con scrapie natural. De todos ellos, detectamos una regulación diferencial en BAMBI y CHGA, por lo que estos dos marcadores se analizaron posteriormente mediante inmunohistoquímica en el modelo ovino y en el modelo murino Tg338. Los cambios de expresión de estos genes tanto a nivel génico como proteico en ambos modelos de scrapie sugieren que podrían desempeñar un papel relevante en la neuropatología de las EETs in vivo, señalándolos a su vez como potenciales biomarcadores de la enfermedad. Además, las proteínas codificadas por BAMBI y CHGA muestran una relación, no sólo con la replicación del prion, sino también con la microgliosis reactiva asociada a estas enfermedades.Por otro lado, los microRNAs (miRNAs) circulantes han sido propuestos como potenciales biomarcadores en una amplia variedad de patologías, incluidas las enfermedades neurodegenerativas. En esta Tesis Doctoral hemos analizado, en plasma sanguíneo y líquido cefalorraquídeo (LCR) de ovino con scrapie, una batería de miRNAs que han mostrado cambios de expresión en otros modelos de EET, demostrando por primera vez alteraciones en los niveles de varios miRNAs circulantes en una enfermedad priónica de origen natural. En los animales infectados con scrapie detectamos un incremento de miR-342-3p y miR-21-5p en plasma, y de miR-342-3p, miR-146a-5p, miR-128-3p y miR-21-5p en LCR, por lo que estas moléculas pueden ser candidatas adecuadas para ser utilizadas como nuevos biomarcadores de la enfermedad. A pesar de que también analizamos sus perfiles de expresión en la fracción exosomal de ambos fluidos biológicos con el fin de concentrar la señal de estos miRNAs y así poder proporcionar un método de diagnóstico más sensible, la purificación de exosomas no mejoró la señal de amplificación de estas moléculas, o al menos, de la batería de miRNAs seleccionada.Finalmente, evaluamos la presencia de la PrPSc en exosomas circulantes mediante PMCA, ya que la circulación del prion a través del organismo podría estar facilitada por estas vesículas y, por tanto, podrían ser en parte responsables de la prionemia descrita en scrapie. En los exosomas aislados de plasma de ovino con scrapie no detectamos la presencia de la proteína patológica, por lo que la fracción exosomal de la sangre no parece estar implicada en la ruta hematógena de neuroinvasión en este hospedador, ni su análisis resulta adecuado para diagnosticar la enfermedad in vivo. Por el contrario, la detección de la PrPSc en los exosomas aislados de LCR podría representar un biomarcador útil para facilitar el diagnóstico in vivo de las EETs durante las últimas etapas de la enfermedad, ya que la amplificación de esta proteína fue positiva en la gran mayoría de muestras procedentes de animales en fase clínica.Mediante un compendio de seis estudios, en esta Tesis Doctoral se ha analizado la implicación de la autofagia en las EETs y se ha profundizado en la validación de potenciales biomarcadores de estas enfermedades mediante el estudio de genes codificantes de proteínas, miRNAs y exosomas circulantes, cumpliendo los objetivos planteados al inicio de la misma.<br /

Caracterización de microorganismos asociados a procesos patológicos en especies de interés veterinario.

Este trabajo fin de grado ha consistido en la realización de un seguimiento diagnóstico post-mortem de un gato con dermatitis necrótica. Se le realizó un estudio histopatológico de la lesión, cultivo del agente y posterior diagnóstico molecular mediante secuenciación génica. La secuencia de nucleótidos obtenida se comparó en la base de datos GenBank donde se mostró un 100% de identidad con Aspergillus tubingensis